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蛋白分离纯化技术之亲和层析的类型

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medicilon_美迪西
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2018-09-27, 10:06
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亲和层析是蛋白质组学研究中重要的技术之一,在生物技术产品、生物分子及组织的分离和纯化领域取得令人瞩目的成就,该项技术一般包含在蛋白分离公司提供的蛋白分离服务项目中。亲和层析是一种吸附层析,在层析的载体上有特殊亲和性的配基,这种配基可以在众多成分中有选择的选中吸附到某一层的层析载体,对其他没有选定的吸附力很小,可以很方便的在混合溶液中分离出单一成分。

近年来,高速发展的生物制药工业已广泛应用亲和层析技术作为其重要的分离纯化和定量测定用于临床药物的工具, 蛋白分离公司往往会采取亲和层析技术进行蛋白的分离与纯化。美迪西是一家临床前CRO公司,提供蛋白分离服务,其在重组蛋白表达与纯化服务方面经验丰富,拥有多种蛋白表达系统,包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统(杆状病毒)哺乳动物细胞蛋白表达系统,具备多种融合技术,可以为客户在蛋白表达与纯化方面提供多种选择。

根据配体和目标分离产物作用力的差异可以分为免疫亲和层析法、生物亲和层析法、金属离子亲和层析和配体亲和层析等。

1、免疫亲和层析法

免疫亲和层析是一种既简单又非常有效的分离抗原的技术。即将抗体共价结合到一种惰性的微珠上,然后将微珠与含有待纯化抗原的溶液混合。当抗原被交联在微珠上的抗体捕获后,通过洗涤去除无关的抗原,然后用洗脱缓冲液处理微珠,结合的抗原被洗脱,从而得到纯化的抗原。如果洗脱条件掌握较好而且比较温和,纯化的抗原仍能保持其天然状态。

免疫亲合层析具有以下特点:①抗体与其相应抗原结合具有高度亲和力和特异性,能大量分离天然状态或近似天然状态的抗原;②不是所有的抗体都适用于免疫亲和层析,但一旦获得一种性能良好的抗体,纯化过程就简单、快速、可靠;③可按照不同规模进行,半天内即可完成,而且可以获得其他层析法不可比拟的纯化效果;④经过简单的改进,免疫亲和层析法也可用于纯化针对抗原的特异性抗体。

2、生物亲和层析法

生物性亲和层析主要是利用溶霉菌无法对底物类似物进行酶解的原理来分离溶菌酶。一般情况下通过酶解产物作为配基可以改变底物容易转为产物的缺点,在分离的效果上较为方便。在实验中使用溶菌酶分解细胞壁,所得的产物作为配体,再连接到琼脂糖中进行亲和层析,可以大大增加酶的提纯能力。不过酶和连接在载体上的酶之间的作用力要小于酶-底物的作用力,但也可以分离出目标酶,一般用来分离提纯粗酶产品,回收率较高。

3、金属离子亲和层析

金属螯合层析是基于固定化金属离子与特异性目的组分相互反应,其组分来自蛋白表面,如氨基酸、多肽类和核酸。此外,关于氨基酸、组氨酸、色氨酸和半胱氨酸的残留在结合蛋白质中起到重要作用。金属螯合层析基质是通过螯合组织将金属离子被固定化在柱子中,如亚氨基二乙酸、次氨基三乙酸和谷氨酸。如Ni2+、Zn2+、Cu2+和Fe3+这些金属离子螯合在这些组分之中。它广泛应用于医药分析,如人铜锌超氧化物歧化酶的分离、人血浆a2巨球蛋白的纯化等等,展示了金属螯合层析的发展前景。

4、配体亲和层析

配体亲和层析的分离程度较生物性亲和层析而言,其分离性能要差,但是有一定的独特性。若使用组氨酸固化到载体上作亲和层析,可以很好的去除溶液中各种分子量的热原,通过不同的载体亲和层析纯化出不同的酶,并且有极高的回收率。而在氨基酸或是多肽物质作为配基时拥有一定的独特性,表现在稳定性能的良好和成本的低廉。在制备的过程中即使配基与产物接触也不会出现免疫反应,不影响最终的产量,唯一不足的地方就是联合的匹配性要求较高,不容易找到相应匹配性产品。

亲和层析最常用于靶标蛋白尤其是疫苗的分离纯化上,特别在融合蛋白的分离纯化上,亲和层析更是起到举足轻重的作用,因为融合蛋白具有特异性结合能力。亲和层析在基因工程亚单位疫苗的分离纯化中应用相当广泛,其中以对分别带有(His)6和GST亲和标记的融合蛋白的抗原Ni-NAT和GST亲和层析应用相当广泛。金属螯和层析与免疫亲和层析也得到一定的应用。

近年来,将亲和层析原理用于定量分析主要与免疫技术相结合,对抗原和抗体进行微量分析,并发展出了放射免疫、酶标免疫及荧光抗体等技术。另外,亲和层析技术被广泛应用于与生物大分子与其特异性作用物的结合常数的测定以及复合物的定量分析。亲和层析技术在临床上已有了较多的应用,例如对糖基化蛋白的定量分析技术。另外,固定有抗人类转铁蛋白的免疫亲和层析柱被应用于对稀释的血清转铁蛋白异构体的纯化和鉴定。

 

 

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