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小分子高通量筛选技术助力抗肿瘤药物的开发

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medicilon_美迪西
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2018-05-17, 09:24
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高通量筛选最初是伴随着组合化学而产生的,是化药筛选的一种方式,随着基因组、合成化学的高通量方法的出现,药物筛选者面临着愈来愈多的新靶标或潜在的有效成分,高通量筛选就是在这样的背景下应运而生的。

药物筛选是临床新药开发的必经过程,是现代药物开发流程中检验和获取具有特定生理活性化合物的一个步骤,指通过规范化的实验手段从大量化合物或新化合物中选择对某一特定作用靶点具有较高活性化合物。美迪西生物医药为客户提供涵盖各种靶标和疾病领域的新药研发服务,包括从活性化合物发现, 靶标验证,先导化合物优化到临床前候选药物的选择。

为了更好的阐述小分子高通量筛选策略在抗肿瘤药物开发过程中的应用,下面来看下以下2个案例。

  1. 高通量筛选在异柠檬酸脱氢酶突变体1/2上的应用

     

    野生型IDH1以同源二聚体的形式存在,在辅因子NADP+存在时催化异柠檬酸转化为α-酮戊二酸。20082009年间,不同的小组分别发现在急性骨髓性白血病AML及胶质母细胞瘤标本中携带有杂合的IDH1基因单个氨基酸突变(R132)。进一步的研究发现,超过75%的某些类型脑部肿瘤以及20%AML患者都携带有IDH1/2突变,并且该突变也发现于其他一些实体瘤中,诸如软骨肉瘤、胆管癌、结直肠癌和前列腺癌等。该基因的突变导致了酶活力的损失,但美国著名的癌症生物制药企业(Agios)的科学家们证实该突变也会导致一些新的获得性功能。代谢谱研究发现,IDH1野生型的产物α-酮戊二酸(α-HG)可被突变型IDH1转化为2-羟基戊二酸二乙酯(2-HG),后者可在IDH1/2突变的肿瘤细胞中累积。2-HG通过影响DNA及组蛋白的甲基化过程等在肿瘤发生和生长过程中扮演重要角色。作为一类药物靶点,IDH1/2比较适合于个性化药物治疗方案的应用,并且据预测,特异性的靶向于IDH1/2突变体在临床上会产生较少的副作用,因为当用药物阻断IDH1/2突变体功能时,不会破坏体内其他生化过程的进行。由此,IDH1/2突变体成为小分子抑制剂类药物开发的重要候选靶点。

 

IDH1/2突变体的作用机制被揭示后,迅速成为各制药公司及学术研究中心开发小分子抑制剂药物的热点领域。考虑到IDH1/2处于三羧酸循环过程中,获得IDH1突变体重组蛋白难度相对较小。困难在于该反应为一个新型的生化反应过程,需要开发出适合于HTS过程的检测方法。2012Agios报道了第一个IDH1突变体抑制剂AG-5198,该化合物采用重组的IDH1 R132H同源二聚体分子开展生化活性高通量筛选而得(细胞中该蛋白最常见的形式为形成野生型/突变体的异源二聚体),具体过程采用了NADPH相关的偶联酶体系。通过生化检测来评估对野生型IDH1的选择性,以及采用基于细胞的检测手段来监控2-HG水平的降低,最终苗头化合物优化成为先导化合物AG-5198。该化合物可以影响携带有IDH1突变体的胶质母细胞瘤生长,并促进其分化,进一步确认了药物的靶点相关性。类似的药物化学策略及筛选方法也被多家机构采纳,并发现了ML309分子。Agios的研发团队则进一步开发出了IDH1突变体抑制剂AG-120IDH2突变体抑制剂AG-221及广谱的IDH1/2抑制剂AG-881,后者能够突破血脑屏障。

尽管这其中很多化合物的具体结构尚无文献批露,上述三类化合物已在AML及其他一系列实体瘤患者中开展临床研究。从对突变体的第一次报道,到有候选药物分子进入临床研究阶段,时间间隔仅为7年。

Enasidenib Mesylate (AG-221)由新基与Agios Pharmaceuticals共同研发,于201781日获美国FDA批准上市,由新基公司在美国上市销售,商品名为Idhifa®2014年,该化合物因急性骨髓性白血病获得美国孤儿药资格。同年,获得美国快速通道资格,于20171月向美国提交上市申请,用于治疗急性骨髓性白血病。

与此同时,其他一些制药公司也针对该类别酶分子靶点开展了药物筛选工作,如赛诺菲以及葛兰素史克等采用类似的筛选策略,所使用的野生型/突变体的异源二聚体为最常见的R132CR132H用于筛选过程。在每一个项目中,研究人员均在追求不同的化学骨架,并且胞内活性通过检测药物对2-HG的产生情况的影响进行评估。Agios也在采用类似方式开展IDH2突变体抑制剂AGI-6780的研究。

2、利用患者来源的原代细胞开展老药新用开发

小分子高通量筛选技术的应用还包括老药新用的开发,以及拓展现有获批上市药物的新适应症。出于此目的,NCGC Pharmaceutical Collection整合了大约2800种临床获批或具有药物活性的小分子,包括FDA批准用于人体或动物应用的药物、其他国家批准的用于人体应用的药物以及出于临床研究阶段的药物。近期采用该策略比较成供的案例是在该药物库中确定了数种候选药物用于慢性淋巴细胞白血病(CLL)的治疗。 

目前临床上对于治疗CLL的新型药物十分迫切,缘于现有治疗方案往往不能治愈,并且在经过现有化疗药物治疗后容易复发。一项基于发光技术的细胞活性检测实验被用于比较库中化合物对来源于六位患者的CLL细胞及正常捐献者细胞毒性的差异。这种表型检测方法有效的覆盖了很多的分子靶点或作用机制,并且重点在于揭示了白血病与正常细胞敏感性差异之间的治疗窗口。通过比较不同药物对六位患者CLL细胞的不同反应,可以确定最佳的候选化合物,分析最敏感的患者细胞的反应,我们会得到356种活性化合物,占比13%;而对于最不敏感的受试细胞,活性化合物有117种,占比为4%。另外,在所有的对6种细胞均具有活性的化合物种,其活性也存在较大差异;最为显著的例子为vinblastine,在两株不同的CLL细胞中其效果差异超过100倍。

采用来源于患者的原代细胞进行高通量筛选具有很明显的优势,同时此研究也表明只采用一种细胞进行药物筛选时,细胞潜在的偏好性会显著影响结果判断,提示我们采用多细胞体系进行筛选的重要性。

在该案例中,有5种化合物对于所有六类CLL原代细胞都有较好的疗效,并且对来源于健康志愿者的淋巴细胞没有任何影响。特别一提的是auranofin,对CLL及正常淋巴细胞的作用差别在30倍左右,表明该化合物对CLL患者而言存在一个潜在的治疗窗口。值得关注的是,对于现有的CLL临床药物,如fludarabine、chlorambucil、bendamustine、mitoxantrone及vincristine等,反而未能从数据上观察到治疗窗口。Auranofin是一种含金的用于治疗类风湿性关节炎的药物,有报道表明其可以抑制硫氧还蛋白还原酶活力。

采用CLL原代细胞及转基因小鼠开展的试验进一步证实了auranofin的疗效,随后该药物在CLL患者中推进到了二期临床研究。此外,auranofin还被开发用于原发性胶质母细胞瘤的辅助治疗。

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